操作規(guī)程 1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細(xì)胞，細(xì)胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時. 2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。 3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時間。 4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。 5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。 6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。 7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。 8、結(jié)果分析 a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100 b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90) 中文名稱：神經(jīng)元示蹤劑—核黃 英文名稱：Nuclear Yellow(Hoechst S769121) 產(chǎn)品規(guī)格：10mg 產(chǎn)品貨號：BJ-01X6605 分子量：651.01 外觀：淡黃色粉末 溶劑：水或者DMSO 光學(xué)特性：Excitation = 355 nm; Emission = 495 nm. 儲存：-20℃，避光，有效期兩年。 Hoechst 系列染料是一類可用于應(yīng)用于熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)分析的標(biāo)記DNA 的熒光家族染料。因其可以標(biāo)記DNA，所以這類染料被廣泛的應(yīng)用于細(xì)胞核和線粒體的可視化定位。Hoechst33258 和Hoechst33342 作為類二苯甲亞胺的染料，是其中廣泛應(yīng)用的核酸染料。這兩種染料都可以被350nm 左右的紫外光激發(fā)，發(fā)射461nm 左右的藍(lán)紫色熒光。Hoechst 染料可以用于固定或者活細(xì)胞染色，也通常被用于另一種核酸染料的替代物，DAPI。他們之間重要的區(qū)別在于Hoechst33342 的乙基可以使其更具有親脂性，因此更易于穿過細(xì)胞膜。在一些應(yīng)用中，Hoechst33258 相比Hoechst33342 表現(xiàn)出較差的膜透性。這類染料也常被用于檢測樣本DNA 的含量，只需要設(shè)置一個熒光強度-DNA 含量之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線即可。 本產(chǎn)品是一種長波的核黃染料，通用和退行性示蹤標(biāo)志染料真藍(lán)做神經(jīng)元的雙色標(biāo)記。在神經(jīng)元細(xì)胞中，核黃優(yōu)先染色細(xì)胞核為黃色熒光，而真藍(lán)作為一種紫外激發(fā)光激發(fā)的二價陽離子染料可以染色細(xì)胞質(zhì)為藍(lán)色熒光。兩種染料在免疫組織化學(xué)應(yīng)用中的表現(xiàn)都非常穩(wěn)定，可以用于和DAB 染料的聯(lián)合應(yīng)用。當(dāng)Hoechst33258、Hoechst33342 和核黃通過軸突逆行運輸?shù)侥讣?xì)胞體后，可能會遷出軸突和母細(xì)胞體，因此可以作為毗鄰神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞核的熒光染料。這種遷出現(xiàn)象在體內(nèi)和體外的研究中，當(dāng)您將切片保存于水性環(huán)境下，都有發(fā)現(xiàn)。使用1%示蹤劑時，活體內(nèi)的遷出現(xiàn)象可以通過限制動物的生存時間而加以控制。體外的遷出現(xiàn)象可以通過材料組織的快速處理來避免。 |
細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程： 一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備： 1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。 2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。 3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。 二． 細(xì)胞處理： 1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。 2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
細(xì)胞培養(yǎng)方法： 1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達到80-90%時即可傳代 ①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次； ②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化； ③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止； ④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清； ⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基； ⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。 2、細(xì)胞復(fù)蘇： ①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。 ②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。 3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時進行細(xì)胞凍存保種 ①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶） ②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化； ③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞； ④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。 Human Papillomavirus 12(HPV-12)人瘤病毒12 LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周 Radix asteris紫菀PCR鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-4周 Taylorella spp.泰勒氏通用探針法熒光定量PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周 Radix changii明黨參PCR鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-4周 Trypanosoma evansi伊氏錐蟲LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周 Streptococcus Suis Type 2 豬鏈球2型LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周 Ophiostoma novoulmi新榆枯萎病PCR試劑盒 植物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周 Swine influenza(SIV)豬流感病毒通用型PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用） 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-4周 Porcine Circovirus 3 (PCV-3)豬圓環(huán)病毒3型探針法熒光定量PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 1-2周 Fasciola spp.大片吸蟲通用探針法熒光定量PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周 Flos campsis凌霄花PCR鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-4周 Herba siegesbeckiae豨薟草LAMP鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-4周 神經(jīng)元示蹤劑—核黃大鼠丙二醛(MDA)免疫試劑盒進口、組裝 人B12(VB12)免疫試劑盒進口、分裝 魚肝細(xì)胞生長因子(HGF)免疫試劑盒*直銷 人錨蛋白B(Ank-B)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng) 氯化鈉B肉湯基礎(chǔ)(SCPB) 英文名稱：Sodium Chloride Polymyxin Broth Base 產(chǎn)品規(guī)格：250g 人結(jié)蛋白(Des)免疫試劑盒*直銷 抗生素檢定培養(yǎng)基5號 英文名稱：Antibiotic No.5（PH8.0) 產(chǎn)品規(guī)格：250g 人單絲蛋白激1(LIMK1)免疫試劑盒進口、組裝 副溶血性弧菌成套生化鑒定管（SN/T0173-2010) 英文名稱： 產(chǎn)品規(guī)格：16種*1套/盒*5盒 人F-肌動蛋白(F-actin)免疫試劑盒進口、分裝 豬補體蛋白4(C4)免疫試劑盒進口、分裝
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