操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

中文名稱：RET激酶抑制劑（RET Kinase inhibitor 1）

英文名稱：RET Kinase inhibitor 1

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|1mg|5mg|10mg|50mg|100mg

產(chǎn)品貨號(hào)：BJ-01X8589

細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

甲型流感 H3N2 (A/Hong Kong/1/1968) 核蛋白 (Nucleoprotein / NP) 基因全長ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)(表達(dá)載體), 無標(biāo)簽細(xì)胞P16蛋白表達(dá)流式細(xì)胞儀檢測試劑盒  10/20次

甲型流感 H3N2 (A/Aichi/2/1968) 核蛋白 (Nucleoprotein / NP) 基因全長ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)(表達(dá)載體), 無標(biāo)簽載玻片細(xì)胞P16蛋白表達(dá)熒光顯微鏡檢測試劑盒  10/20次

甲型流感 H1N1 (A/USSR/90/1977) 核蛋白 (Nucleoprotein / NP) 基因全長ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)(表達(dá)載體), 無標(biāo)簽冰凍切片組織P16蛋白表達(dá)熒光顯微鏡檢測試劑盒  10/20次

甲型流感 H1N1 (A/California/07/2009) 核蛋白 (Nucleoprotein / NP) 基因全長ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)(表達(dá)載體), 無標(biāo)簽石蠟切片組織P16蛋白表達(dá)熒光顯微鏡檢測試劑盒  10/20次

甲型流感 H1N1 (A/Puerto Rico/8/1934) 核蛋白 (Nucleoprotein / NP) 基因全長ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)(表達(dá)載體), 無標(biāo)簽載玻片細(xì)胞P16蛋白表達(dá)NBT顯色光學(xué)顯微鏡檢測試劑盒  10/20次

甲型流感 H1N1 (A/Brevig Mission/1/1918) 核蛋白 (Nucleoprotein / NP) 基因全長ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)(表達(dá)載體), 無標(biāo)簽凍切片組織P16蛋白表達(dá)NBT顯色光學(xué)顯微鏡檢測試劑盒  10/20次

甲型流感 H7N7 (A/Netherlands/219/2003) Matrix protein 1 / M1 基因全長ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)(表達(dá)載體), 無標(biāo)簽石蠟切片組織P16蛋白表達(dá)NBT顯色光學(xué)顯微鏡檢測試劑盒  10/20次

甲型流感 H3N2 (A/Hong Kong/1/1968) Matrix protein 1 / M1 基因全長ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)(表達(dá)載體), 無標(biāo)簽細(xì)胞P16蛋白表達(dá)比色法定量檢測試劑盒  10/50次

甲型流感 H3N2 (A/Aichi/2/1968) Matrix protein 1 / M1 基因全長ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)(表達(dá)載體), 無標(biāo)簽細(xì)胞P16蛋白表達(dá)熒光定量檢測試劑盒  10/50次

甲型流感 H2N2 (A/Japan/305/1957) Matrix protein 1 / M1 基因全長ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)(表達(dá)載體), 無標(biāo)簽P16蛋白表達(dá)西方雜交分析試劑盒  5次

甲型流感 H1N1 (A/USSR/90/1977) Matrix protein 1 / M1 基因全長ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)(表達(dá)載體), 無標(biāo)簽P16蛋白免疫共沉淀分析試劑盒  5次

RET激酶抑制劑（RET Kinase inhibitor 1）Mouse Anti-Guinea pig IgG/Cy5  Cy5標(biāo)記的小鼠抗豚鼠IgG 規(guī)格: 0.1ml

LMW Kininogen/Kininogen 1  低分子量生促進(jìn)因子抗體（激肽原1） 規(guī)格: 0.2ml

TEF3/TEAD4  轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子TEF3抗體 規(guī)格: 0.2ml

TSPAN20/UPIb  四分子交聯(lián)體20抗體（四旋蛋白） 規(guī)格: 0.2ml

FGF21  成纖維細(xì)胞生因子21抗體 規(guī)格: 0.1mlRACK1  受體激活蛋白激C1抗體 規(guī)格: 0.2ml

Acinus  Acinus抗體 0.2ml

PLEKHM1  石骨癥相關(guān)蛋白PLEKHM1抗體 規(guī)格: 0.2ml

Sidekick 1  細(xì)胞粘附分子伴侶蛋白1抗體 規(guī)格: 0.2ml

TRIB3/p65 interacting inhibitor of NF-kappaB  神經(jīng)細(xì)胞死亡誘導(dǎo)蛋白激抗體 規(guī)格: 0.1ml

beta-Actin (Loading Control)  β-肌動(dòng)蛋白抗體（內(nèi)參抗體） 0.1mlGoat anti-rat IgG whole serum  羊抗大鼠IgG抗清 規(guī)格: 1ml

BASP1/Nap22  腦富含膜附著信號(hào)蛋白1抗體 規(guī)格: 0.2ml