操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

中文名稱：CDK抑制劑(NU2058)

英文名稱：NU2058

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg

產(chǎn)品貨號：BJ-01X8483

細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

食蟹猴 TSPAN7 基因全長ORF克隆動物上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)試劑盒  10次

食蟹猴 ENPP3 基因全長ORF克隆動物眼組織細(xì)胞分離培養(yǎng)試劑盒  10次

食蟹猴 CCR7 基因全長ORF克隆動物心臟組織細(xì)胞分離培養(yǎng)試劑盒  10次

食蟹猴 CXCR5 基因全長ORF克隆動物小腸組織細(xì)胞分離培養(yǎng)試劑盒  10次

食蟹猴 CCR9 基因全長ORF克隆動物腎臟組織細(xì)胞分離培養(yǎng)試劑盒  10次

食蟹猴 CXCR3 基因全長ORF克隆動物肝組織細(xì)胞分離培養(yǎng)試劑盒  10次

食蟹猴 CCR4 基因全長ORF克隆動物肺組織細(xì)胞分離培養(yǎng)試劑盒  10次

食蟹猴 CCR2B 基因全長ORF克隆動物結(jié)組織細(xì)胞分離培養(yǎng)試劑盒  10次

食蟹猴 CCR1 基因全長ORF克隆動物乳腺組織細(xì)胞分離培養(yǎng)試劑盒  10次

食蟹猴 CCR3 基因全長ORF克隆動物肌肉組織細(xì)胞分離培養(yǎng)試劑盒  10次

食蟹猴 CCR5 基因全長ORF克隆動物神經(jīng)組織細(xì)胞分離培養(yǎng)試劑盒  10次

CDK抑制劑(NU2058)2 ug pAc5.1/V5-His C pAc5.1/V5-His C 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

RODAC培養(yǎng)皿（TSA）55mm  55mm

1瓶 BE(2)-M17細(xì)胞株 BE(2)-M17 低溫運(yùn)輸和保存

7.5%氯化鈉肉湯顆粒 7.5% Sodium Chloride Broth 225ml/袋*10

10次 克必隆eTS miRNA RT-PCR試劑盒  

125mL NP40 Lysis Buffer,2X（NP40裂解液，2X） NP40 Lysis Buffer,2X 常溫保存

10ug M13mp 18  DNA（雙鏈） M13mp18 DNA -20℃保存

2 ug pAP1（PMA）-Luc pAP1（PMA）-Luc 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

50次 即用型熒光定量RT-PCR試劑盒 Instant Realtime RT-PCR Kit -20℃保存

1瓶 SV40 MES 13細(xì)胞株 SV40 MES 13 低溫運(yùn)輸和保存

賴脫羧培養(yǎng)基 Lysine-decarboxylase Test Broth 5g