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Calcein-AM/PI活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒
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產(chǎn)品特點(diǎn):
Calcein-AM/PI活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒公司正在出售的產(chǎn)品:0.156-10 ng/mL 人轉(zhuǎn)錄因子RelB蛋白ELISA試劑盒 31.2-2000 pg/mL ELISA Kit for Human Interferon alpha-inducible protein 6 0.156-10 ng/mL ELISA Kit for Human Cytoplasmic tyrosine-p
  Calcein-AM/PI活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒的詳細(xì)資料:

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔,通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞,細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000~10000個(gè)細(xì)胞(具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目,需根據(jù)細(xì)胞的大小,細(xì)胞增殖速度的快慢等決定)。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0~10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃,含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液,在37℃孵育4小時(shí),使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液,每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解,用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度(如無570nm 濾光片,可以使用560-600nm 的濾光片)。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率:將各測試孔的OD 值減去本底OD 值(*培養(yǎng)基加MTT,無細(xì)胞)或空白藥物孔OD 值(*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT,無細(xì)胞),各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示,T 為加藥細(xì)胞的OD 值,C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =(加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD)×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

中文名稱:Calcein-AM/PI活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒

英文名稱:Calcein-AM/PI Double Stain Kit

產(chǎn)品規(guī)格:500T

產(chǎn)品貨號:BJ-01X6448

Calcein-AM是一種對活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞染色試劑,發(fā)綠色熒光(Ex=490nm, Em=515nm)。因其在傳統(tǒng)的Calcein(鈣黃綠素)基礎(chǔ)上引入乙酰甲氧基甲酯(AM)基團(tuán),增加了疏水性,使其能夠輕易穿透活細(xì)胞膜。一旦進(jìn)入細(xì)胞后,Calcein-AM(本身不發(fā)熒光)被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein,從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)并發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。與其它同類試劑(如BCECF-AM和CFDA)相比,由于Calcein, AM細(xì)胞毒性極低,是適合用于活細(xì)胞染色的熒光探針,而且不會抑制任何的細(xì)胞功能,如增殖和淋巴球的趨化性。

由于死細(xì)胞缺乏酯酶,Calcein-AM僅用于對活細(xì)胞的細(xì)胞生存能力測試和短期標(biāo)記。因此,Calcein-AM常常與死細(xì)胞熒光探針如碘化丙啶(PI)等聯(lián)合使用,同時(shí)進(jìn)行活細(xì)胞和死細(xì)胞的熒光雙重染色。碘化丙啶(Propidium iodide,PI)不能穿過活細(xì)胞的細(xì)胞膜,僅能穿過死細(xì)胞膜的無序區(qū)域而到達(dá)細(xì)胞核,并嵌入細(xì)胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光(Ex=535 nm, Em=617 nm),因此PI僅對死細(xì)胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激發(fā),因此可用熒光顯微鏡同時(shí)觀察活細(xì)胞和死細(xì)胞。而用545 nm激發(fā),僅可觀察到死細(xì)胞。

本試劑盒的工作原理就在于Calcein-AM和PI的雙重染料,來進(jìn)行活細(xì)胞和死細(xì)胞的雙重染色標(biāo)記,從而進(jìn)行活細(xì)胞和死細(xì)胞水平的分析。根據(jù)我司優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)體系,單次就200μl細(xì)胞懸液進(jìn)行染色。

注意事項(xiàng)

1)由于Calcein-AM對濕度非常敏感,若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后,必須緊緊密封蓋子。建議根據(jù)單次用量,分裝密封保存。Calcein-AM工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用。

2)碘化丙啶(PI)有一定的致癌性,操作時(shí)一定要注意防護(hù)。若接觸到皮膚,需要立即用自來水清洗。

3)為了您的安全和健康,請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

儲存條件:-20℃,有效期12個(gè)月

細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程:

一.培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備:

1) 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基;優(yōu)質(zhì)胎牛血清,10%;雙抗,1%。

2) 培養(yǎng)條件: 氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%。 溫度:37℃,培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3) 凍存液:90%血清,10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配。

二. 細(xì)胞處理:

1) 復(fù)蘇細(xì)胞:將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中(水面要低于凍存管蓋部)搖晃解凍,移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2) 細(xì)胞傳代:如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。


2.png

細(xì)胞培養(yǎng)方法:

1、細(xì)胞傳代:細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清,用PBS或生理鹽水清洗1-2次;

②加入2ml0.25%(T25瓶),使覆蓋整個(gè)瓶或皿,蓋好放入培養(yǎng)箱消化;

③1-2min后,顯微鏡下觀察細(xì)胞,若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化;若細(xì)胞還是貼壁,放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止;

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,棄上清;

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基;

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集,細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇:

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,時(shí)間1min左右,加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min,棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存:待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,用PBS或生理鹽水清洗1-2次,加入1mL 0.25%(T25瓶)

②1-2min后,顯微鏡下觀察細(xì)胞,大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化;

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,棄上清,加1ml凍存液重懸細(xì)胞;

④將凍存管放入程序降溫盒,放入-80℃冰箱,4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

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