操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細(xì)胞，細(xì)胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

中文名稱：mTOR激酶抑制劑(CC-223)

英文名稱：CC-223

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg

產(chǎn)品貨號：BJ-01X7848

細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

二咖啡酰菊苣酸

英文別名：   (2r,3r)-2,3-bis[[(e)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-enoyl]oxy]butanedioic acid

CAS登錄號：   70831-56-0

分子式：   C22H18O12

分子量：   474.37

3,4,5-三咖啡酰奎寧酸

英文別名：   (1alpha,3R,4alpha,5R)-3,4,5-Tris[[(2E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-1-oxo-2-propen-1-yl]oxy]-1-hydroxycyclohexanecarboxylic acid

CAS登錄號：   86632-03-3

分子式：   C34H30O15

分子量：   678.59

5,7-二羥基色原酮

英文別名：   5,7-Dihydroxychromen-4-one

CAS登錄號：   31721-94-5

分子式：   C9H6O4

分子量：   178.14

伽升沃D

英文名：   Garcinone D

英文別名：   1,3,6-Trihydroxy-8-(3-hydroxy-3-methylbutyl)-7-methoxy-2-(3-methyl-2-buten-1-yl)-9H-xanthen-9-one

CAS登錄號：   107390-08-9

分子式：   C24H28 O7

伽升沃 C

英文名：   Garcinone C

英文別名：   1,3,6,7-Tetrahydroxy-8-(3-hydroxy-3-methylbutyl)-2-(3-methyl-2-buten-1-yl)-9H-xanthen-9-one

CAS登錄號：   76996-27-5

分子式：   C23H26O7

水飛薊汀

英文名：   Silicristin

英文別名：   hydroxy-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-(hydroxymethyl)-5-benzofuranyl]-2,3-dihydro-3,5,7-trihydroxy-,(2R,3R)

CAS登錄號：   33889-69-9

分子式：   C25H22O10

水飛薊寧

英文別名：   3R,8R)-2,3,3aβ,7a-Tetrahydro-7aβ-hydroxy-8-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-4-[(2R,3R)-3,5,7-trihydroxy-3,4-dihydro-4-oxo-2H-1-benzopyran-2-yl]-3α,6α-methanobenzofuran-7(6H)-one

CAS登錄號：   29782-68-1

分子式：   C25H22O10

分子量：   482.44

刺囊酸

英文別名：   (3beta,16alpha)-3,16-dihydroxyolean-12-en-28-oic acid

CAS登錄號：   510-30-5

分子式：   C30H48O4

分子量：   472.7

杯莧甾酮

英文別名：   (22R,24S,25S,28R)-2β,3β,14,20,22,28-Hexahydroxy-6-oxo(26-13C)-5β-stigmasta-7-ene-26-oic acid γ-lactone

CAS登錄號：   17086-76-9

分子式：   C29H44O8

分子量：   520.65

原花青素B1

英文名：   Proanthocyanidin B1

英文別名：   2R,2'R,3R,3'S,4β)-3,3',4,4'-Tetrahydro-2α,2'α-bis(3,4-dihydroxyphenyl)-4,8'-bi[2H-1-benzopyran]-3,3',5,5',7,7'-hexol

CAS登錄號：   20315-25-7

分子式：   C30H26O12

蒙花苷

英文名：   Buddleoside

英文別名：   7-[[6-O-(6-deoxy-alpha-L-mannopyranosyl)-beta-D-glucopyranosyl]oxy]-5-hydroxy-2-(4-methoxyphenyl)-4H-benzopyran-4-one

CAS登錄號：   480-36-4

分子式：   C28H32O14

mTOR激酶抑制劑(CC-223)油紅染色試劑盒  100T  改良EC肉湯(mEC+n)顆粒 Modified EC Broth 225ml/袋*10

茜素紅染色液(ph4.2)  10ml  100µL 即用型GFP標(biāo)簽蛋白裂解液 GFP-Tagged Protein Lysate -20℃保存

BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒  共100ml  BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit2 ug pTCK303 pTCK303 低溫運輸，-20℃保存

MASSON三色染色試劑盒(亮綠，用于膠原纖維染色)  8ml/瓶/盒  4次 大提柱式動物DNAout Maxi Column Animal DNAOUT 常溫

蘇木素染液  100ml  Haematorylin Staining Solution2 ug pDR195 pDR195 低溫運輸，-20℃保存

結(jié)晶紫染色液  100ml  50%卵黃乳液 50% egg Yolk emulsion 5ml*10

蘇木素-伊紅(H-E)染液  200ml  100mL 瓊脂糖凝膠 4B Sepharose 4B 4-8℃保存

伊紅染液  100ml  50T 蟹特定基因序列PCR檢測試劑盒  低溫運輸，-20℃保存

姬姆薩染液(10×)  25ml  200 mL 大鼠 NK 細(xì)胞分離液1.068 Cell Separation Solution -20℃保存

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紅色熒光探針(ER-Tracker Red)  20μL  100mL Glycylglycine Buffer,0.5M,pH8.0   Glycylglycine Buffer,0.5M,pH8.0   常溫保存

DiOC6(3)碘化物  10mg  3,3’-Dihexyloxacarbocyanine iodide七葉苷生化管  20支