培養(yǎng)操作步驟 ：

1．用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時；

4．將經(jīng)過計數(shù)的細胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當貼壁細胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進行快速固定以及免疫細胞化學檢測。 

產(chǎn)品參數(shù)：

商品詳細介紹：

實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

實驗要點及說明：

1．本方法適用于貼壁細胞培養(yǎng)，而不適用于懸浮細胞培養(yǎng)，懸浮細胞可使用滴片法；

2．所使用的蓋玻片應該為優(yōu)質(zhì)玻璃，并經(jīng)過鉻酸洗液處理；

3．蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時動作要輕；

4．如果需要更多生長狀態(tài)一致的細胞，可以使用較大的培養(yǎng)皿，但不宜過大，以避免培養(yǎng)液的浪費和增加污染機率；

5．如果細胞貼壁生長能力較差，可將蓋玻片在0.5%多聚賴氨酸溶液中浸泡5-10分鐘并自然晾干。

操作要點：

1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預熱；準備一個15mL無菌的離心管，加入8mL預熱培養(yǎng)基。

2）將凍存細胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復溫（可準備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動凍存管，使細胞能在1~2min內(nèi)*解凍，使細胞能盡快通過最易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，BRL(大鼠肝細胞)避免引起污染。

3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內(nèi)，將管內(nèi)細胞轉(zhuǎn)移至準備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。

4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細胞懸液。

5）將細胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細胞瓶內(nèi)，補加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

6）第二天觀察細胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞長至80~90%匯合時正常傳代。一般剛復蘇的細胞需經(jīng)過2~3次傳代，細胞活力恢復后才能進行后續(xù)的實驗。

人 CD66e / CEACAM5 基因全長ORF克隆 (表達載體), 帶FLAG標簽活力和頂體反應三色（triple staining）染色試劑盒  50次

人 PRMT5 基因全長ORF克隆 (表達載體), 無標簽頂體形態(tài)花生凝集素熒光標記（PNA-FITC）染色試劑盒  20次

人 TrkA / NTRK1 基因全長ORF克隆 (表達載體), 無標簽頂體形態(tài)豌豆凝集素熒光標記（PSA-FITC）染色試劑盒  20次

人 TrkA / NTRK1 基因全長ORF克隆 (表達載體), 帶FLAG標簽頂體形態(tài)刀A凝集素熒光標記（ConA-FITC）染色試劑盒  20次

人 MS4A1 基因全長ORF克隆 (表達載體), 無標簽活力和頂體形態(tài)雙重熒光染色試劑盒  20次

人 MS4A1 基因全長ORF克隆 (表達載體), 帶FLAG標簽膜功能低滲膨脹法（HOST）檢測試劑盒  50次

人 CD3E 基因全長ORF克隆 (表達載體), 無標簽DNA吖啶橙（acridine orange）熒光檢測試劑盒  50次

人 CD200 基因全長ORF克隆 (表達載體), 無標簽形態(tài)肖爾（shorr）染色試劑盒  20次

人 EphrinB2 基因全長ORF克隆 (表達載體), 無標簽精液粒性白細胞染色試劑盒  50次

人 MFG-E8 基因全長ORF克隆 (表達載體), 無標簽精漿鋅含量比色法定量檢測試劑盒  20次

人 MFG-E8 基因全長ORF克隆 (表達載體), 帶FLAG標簽精漿果糖含量比色法定量檢測試劑盒  20次

ERRβ和ERRγ激動劑（DY131）HCLS1/LckBP1  造干細胞特異性蛋白抗體 規(guī)格: 0.1ml

Rabbit Anti-chicken IgM/Alexa Fluor 555  Alexa Fluor 555標記的兔抗雞IgM 規(guī)格: 0.1ml

TBL1Y  轉(zhuǎn)導β樣蛋白1抗體 規(guī)格: 0.2ml

UCHL5IP  泛素羧基末端水解5互相作用蛋白1抗體 規(guī)格: 0.2mlNIPAL2  NIPAL2蛋白抗體 規(guī)格: 0.2ml

Acetyl-Histone H3(K9)  乙?；M蛋白H3抗體 規(guī)格: 0.1ml

STARD5  促黃體激素誘導蛋白5抗體 規(guī)格: 0.2ml

VIP Receptor 1/VAPC1  管活性腸肽受體-1抗體 0.1ml

Phospho-Pin1 (Ser16)  磷酸化肽基脯氨酞順反異構(gòu)Pinl抗體 規(guī)格: 0.1ml

GRK2/BARK1/ADRBK1  G蛋白偶合受體激2抗體 規(guī)格: 0.1mlE3 ubiquitin ligase/RNF218  E3泛素連接抗體 規(guī)格: 0.2ml

phospho-DOK1(Tyr362)  磷酸化D酪激衰減蛋白1抗體 規(guī)格: 0.1ml

phospho-HP1 alpha (Tyr24)  磷酸化異染色質(zhì)蛋白1抗體（果蠅） 規(guī)格: 1ml