培養(yǎng)操作步驟 ：

1．用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。 

產(chǎn)品參數(shù)：

商品詳細(xì)介紹：

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大?。?/span>

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說明：

1．本方法適用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，而不適用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，懸浮細(xì)胞可使用滴片法；

2．所使用的蓋玻片應(yīng)該為優(yōu)質(zhì)玻璃，并經(jīng)過鉻酸洗液處理；

3．蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時(shí)動(dòng)作要輕；

4．如果需要更多生長狀態(tài)一致的細(xì)胞，可以使用較大的培養(yǎng)皿，但不宜過大，以避免培養(yǎng)液的浪費(fèi)和增加污染機(jī)率；

5．如果細(xì)胞貼壁生長能力較差，可將蓋玻片在0.5%多聚賴氨酸溶液中浸泡5-10分鐘并自然晾干。

操作要點(diǎn)：

1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱；準(zhǔn)備一個(gè)15mL無菌的離心管，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。

2）將凍存細(xì)胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準(zhǔn)備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細(xì)胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動(dòng)凍存管，使細(xì)胞能在1~2min內(nèi)*解凍，使細(xì)胞能盡快通過最易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，BRL(大鼠肝細(xì)胞)避免引起污染。

3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺(tái)內(nèi)，將管內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細(xì)胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。

4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細(xì)胞懸液。

5）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶內(nèi)，補(bǔ)加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)細(xì)胞瓶使細(xì)胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

6）第二天觀察細(xì)胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80~90%匯合時(shí)正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細(xì)胞需經(jīng)過2~3次傳代，細(xì)胞活力恢復(fù)后才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

大鼠 NTRK2 基因全長ORF克隆 (表達(dá)載體), 無標(biāo)簽盤基網(wǎng)柄（Dicyostelium）細(xì)胞趨化作用（chemotaxis）  10次

大鼠 NTRK2 基因全長ORF克隆 (表達(dá)載體), 帶FLAG標(biāo)簽軟瓊脂檢測試劑盒  

小鼠 VDR 基因全長ORF克隆 (表達(dá)載體), 無標(biāo)簽細(xì)細(xì)胞趨化作用（chemotaxis）軟瓊脂檢測試劑盒  10次

小鼠 IL17A 基因全長ORF克隆 (表達(dá)載體), 無標(biāo)簽通用型細(xì)胞粘附性（cell adhesion）比色法檢測試劑盒  50次

小鼠 IL17A 基因全長ORF克隆 (表達(dá)載體), 帶FLAG標(biāo)簽通用型細(xì)胞粘附性（cell adhesion）熒光檢測試劑盒  50次

小鼠 IL2 基因全長ORF克隆 (表達(dá)載體), 無標(biāo)簽通用型血液凝集分子纖維蛋白檢測法（Fibrometer）分析試劑盒  50次

小鼠 IL2 基因全長ORF克隆 (表達(dá)載體), 帶FLAG標(biāo)簽肝素（heperin）纖維蛋白檢測法（Fibrometer）分析試劑盒  50次

小鼠 LIGHT / TNFSF14 基因全長ORF克隆 (表達(dá)載體), 無標(biāo)簽肝素（heperin）活性比色法定量檢測試劑盒  20次

小鼠 LIGHT / TNFSF14 基因全長ORF克隆 (表達(dá)載體), 帶FLAG標(biāo)簽肝素（heperin）活性比色法定量檢測試劑盒  20次

小鼠 CCR2 基因全長ORF克隆 (表達(dá)載體), 無標(biāo)簽水蛭素（hirudin）纖維蛋白檢測法（Fibrometer）分析試劑盒  50次

小鼠 CCR2 基因全長ORF克隆 (表達(dá)載體), 帶FLAG標(biāo)簽水蛭素（hirudin）活性比色法定量檢測試劑盒  20次

menin-mLL相互作用抑制劑(MI-503)phospho-IKK beta(Tyr199)  磷酸化KB抑制蛋白激β抗體 規(guī)格: 0.1ml

SSTR1  生抑素受體1抗體 規(guī)格: 0.1ml

TXNRD1  硫氧環(huán)蛋白還原1抗體 規(guī)格: 0.2mlMCK10/CD167a/DDR1  神經(jīng)上皮酪激抗體（激10） 規(guī)格: 0.1ml

Cystatin E/M  半胱蛋白抑制劑6抗體 規(guī)格: 0.1ml

Histone H3 (mono methyl K79)  單甲基組蛋白H3K9抗體 規(guī)格: 0.2ml

RNF32  環(huán)指蛋白32抗體 規(guī)格: 0.2ml

BLAME/SLAMF8  BLAME抗體 規(guī)格: 0.1ml

NHLRC2  非霍奇金重復(fù)蛋白2抗體 規(guī)格: 0.2mlphospho-MEK5(Ser142)  磷酸化絲裂原活化蛋白激激5抗體 規(guī)格: 0.1ml

POC5  細(xì)胞中心粒蛋白抗體 規(guī)格: 0.2ml

KLHDC9  KLHDC9蛋白抗體 規(guī)格: 0.2ml

ACCN1/BNaC1/ASIC2  腦鈉通道蛋白1抗體 規(guī)格: 0.2mlTSPY1  睪特異定蛋白質(zhì)編碼Y1抗體 規(guī)格: 0.1ml