操作規(guī)程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

中文名稱：BRAF抑制劑(Dabrafenib Mesylate)

英文名稱：Dabrafenib Mesylate

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg

產(chǎn)品貨號：BJ-01X7360

細胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1） 準備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

細胞培養(yǎng)方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

Enterohemorrhagic E. coli(EHEC)腸出血性大腸桿O157:H7血清型探針法熒光定量PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周Cytosine deaminase  胞嘧啶脫氨抗體 0.2mlSIGLEC14  唾液酸結(jié)合性免疫球蛋白樣凝集素14抗體 規(guī)格: 0.2ml

Sepik Virus塞皮克病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周Calretinin/CA  鈣結(jié)合蛋白抗體 規(guī)格: 0.1mlMURF3  肌肉特異性環(huán)指蛋白3抗體 規(guī)格: 0.2ml

Washington University Polyomavirus（WUPyV）WU多瘤病毒染料法熒光定量PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周RIP3  受體結(jié)合絲蘇激3抗體 規(guī)格: 0.2mlADAM20  去整合素樣金屬蛋白20抗體 規(guī)格: 0.2ml

Borrelia anserina鵝疏螺旋體（鵝包柔螺旋體）LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周G protein alpha S  G蛋白αS抗體（核苷酸結(jié)合蛋白Gα s） 規(guī)格: 0.2mlphospho-Bid(Ser61)  磷酸化BH3結(jié)構(gòu)域凋亡誘導蛋白抗體 規(guī)格: 0.1ml

Xanthomonas hyacinthi風信子黃腐病PCR試劑盒 植物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周KLK11  激肽釋放11抗體 規(guī)格: 0.1mlIRF3  干擾素調(diào)節(jié)因子3 規(guī)格: 0.1ml

Radix astragali preparata炙黃芪PCR鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-4周NADE/NGFRAP1  神經(jīng)生因子受體相關(guān)蛋白1抗體 規(guī)格: 0.2mlMMS21/NSE2  E3連接MMS21蛋白抗體 規(guī)格: 0.2ml

Staphylococcus pseudintermedius偽中間型葡萄球LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周Kv4.3/KCND3  離子通道蛋白Kv4.3抗體 規(guī)格: 0.1mlMICS1  生激素誘導跨膜蛋白抗體（真皮源性蛋白2） 規(guī)格: 0.2ml

Avian Metapneumovirus(aMPV)禽偏肺病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周FADD  Fas死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白 規(guī)格: 0.1mlCobra poison Protein  眼鏡蛇蛇毒蛋白抗體 規(guī)格: 0.2ml

Pericarpium trichosanthis瓜蔞皮探針法PCR鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-4周NAP1L2  腦特異性蛋白BPX抗體 規(guī)格: 0.2mlHepatitis E Virus ORF3   毒抗體 規(guī)格: 0.1ml

Brucella bovis牛布魯氏桿LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周Thymosin Alpha-1/PTMA  胸肽α1抗體 規(guī)格: 0.1mlCripto 1 monoclonal (CT)  畸胎瘤衍化生因子單克隆抗體(C端) 規(guī)格: 0.1ml

BRAF抑制劑(Dabrafenib Mesylate)單倍體生殖細胞特異性核蛋白激酶Haspin抑制劑（CHR-6494）

topoisomerase抑制劑(Amsacrine)

RSK2抑制劑(FMK)

Raf抑制劑(MLN 2480)

ROCK1和ROCK2小分子抑制劑(RKI-1447)

胸苷磷酸化酶抑制劑(Tipiracil hydrochloride)

CDK抑制劑(PHA-793887)

PI3Ks抑制劑(XL147)

PI4KIIIβ抑制劑(PIK-93)

Aurora B和C抑制劑（GSK1070916）

可逆FAK和Pyk2激酶抑制劑(PF-562271)