操作步驟：
1）、冷凍前24-48小時更換半量或全量培養(yǎng)基，使細(xì)胞處于指數(shù)生長期。
2）、配制冷凍保存溶液(使用前配制)：另取一離心管，加入培養(yǎng)基、血清，逐滴加入二甲基亞砜 (DMSO)至20%濃度，即制成雙倍的凍存液，置于室溫下待用。
3）、離心收集培養(yǎng)之細(xì)胞，用加血清的培養(yǎng)基重懸起細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液(約0. 1 ml)計數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。
4）、取與細(xì)胞懸液等量的凍存液，緩慢逐滴加入細(xì)胞懸液，并晃動試管，制成細(xì)胞凍存懸液(DMSO后濃度為5～10%)，使細(xì)胞濃度為1～5×106cells/ ml，混合均勻，分裝于已標(biāo)示全之冷凍保存管中，1～2 ml/vial，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測。嚴(yán)密封口后，注明細(xì)胞名稱、代數(shù)、日期。然后進行凍存。
注意事項：
1）、欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長良好(logphase)且存活率高之狀態(tài)，約為80～90%致密度。冷凍前檢測細(xì)胞是否仍保有其有性質(zhì)，例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。
2）、細(xì)胞在液氮中可長期凍存，而不會影響細(xì)胞活力;在-70度可保存數(shù)月。
3）、注意冷凍保護劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級等級，無菌且無色(以0. 22micron FGLP Telflon過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650)，以5～10 ml小體積分裝，4 ℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol亦應(yīng)為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細(xì)胞會有毒性。本方法中先制備雙倍凍存液，可避免DMSO直接加入時釋放的熱量對細(xì)胞的損傷。緩慢逐滴加入細(xì)胞懸液是使細(xì)胞逐步適應(yīng)高滲，可降低細(xì)胞受損。DMSO可能引起部分白血病細(xì)胞株的分化，可換用10%甘油凍存。